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LA SIEROLOGIA NELL’INFEZIONE DA SARS-CoV-2

 

La metodica di riferimento, per gli studi sierologici, dei pazienti con SARS-CoV-2 è il test di neutralizzazione (PRNT), come dimostrato in letteratura (1). Test sierologici di routine, sensibili, specifici e validati, forniscono informazioni sulle infezioni asintomatiche e sulla prevalenza della malattia, attraverso studi di siero-sorveglianza (2,3). 

Esiste un ELISA basato su Receptor Binding Domain e proteina N, più sensibile dell'ELISA S1 nel rilevare gli anticorpi, sia IgA che IgG, nei pazienti con forme “mild”. Vi sono indicazioni, dedotte da una cross-reazione, che esista una risposta anticorpale ad una terza proteina (da individuare), comune a tutti i coronavirus (1,4). I kit RBD mostrano correlazione con i titoli PRNT50. I test ELISA IgA e IgG, basati su S1, devono essere saggiati ulteriormente, in laboratori di riferimento e titolati. Sebbene entrambi gli isotipi IgA e IgG siano validi, per la diagnosi sierologica, le IgG, in vivo, hanno una persistenza più lunga e si preferiscono per l’uso di routine.

  • In un report recente, su 13 campioni post acuzie COVID-19, sono stati eseguiti isotipizzazione e sottotipizzazione, con un ELISA basato su proteine S, espresse in cellule di mammifero, da cui risulta una forte reattività, in tutti i campioni, per IgG3, IgM e IgA che correlava significativamente con l'attività di microneutralizzazione contro l'isolato USA-WA1/2020, con uno Spearman r di 0,9279. Il dato è interessante poiché il sottotipo IgG3 ha un'affinità più forte, nell’attivazione dei recettori per Fc dei linfociti e di altre cellule immunocompetenti. I recettori Fc limitano il catabolismo delle IgG e le trasportano attraverso le barriere cellulari (epiteli). Forti risposte IgA e IgM sono state dimostrate, con caratteristiche vicine ai modelli attesi (5).
  • Per valutare le infezioni inapparenti, sono stati utilizzati 52 casi sospetti, di soggetti con sintomi di COVID-19 o anomalie radiologiche, ma con test eziologico negativo, in due campioni sequenziali. Dei 52 casi, quattro avevano IgG o IgM specifiche nei campioni iniziali, il paziente n.3 ha avuto un aumento, maggiore di quattro volte, del titolo di IgG, tre giorni dopo il test sierologico iniziale e si è positivizzato al test RT-PCR successivamente. Il titolo di IgM aumentava longitudinalmente nel paziente n.1; il paziente n. 4 mostrava titoli di IgG 100 volte e titoli di IgM 10 volte più alti, rispetto al cutoff, in due campioni sequenziali. Il paziente n.2 era positivo sia per IgG che per IgM specifiche. Un aumento di IgG e/o di IgM, in campioni successivi, suggeriscono che questi quattro pazienti fossero stati infettati con SARS-CoV-2.
  • È stata dimostrata l'utilità del test sierologico, con funzione di sorveglianza, in un gruppo di 164 contatti di pazienti, con malattia COVID-19 certa. Sedici erano positivi per SARS-CoV-2 mediante RT-PCR, tre dei quali senza sintomi. Le altre 148 persone erano negative con RT-PCR e nessun sintomo. I campioni raccolti da questi, per il dosaggio degli anticorpi, trenta giorni dopo l'esposizione (nei 16 casi confermati con RT-PCR) erano tutti positivi per IgG e/o IgM specifiche. Dei 148 individui, risultati negativi per RT-PCR, sette erano positivi per IgG e/o IgM specifiche, indicando che il 4,3% (7/164), di contatti stretti, era sfuggito al test RT-PCR. Dieci dei 164 contatti che presentavano IgG e/o IgM specifiche erano stati sempre asintomatici (6).

 

CONCLUSIONI

Il rilevamento di anticorpi specifici è importante, come complemento al test dell'acido nucleico, su casi sospetti RT–PCR negativi, per dimostrare infezione asintomatica nei contatti. Smascherare i casi sospetti, precocemente, con i test sierologici, riduce il rischio di esposizione e risparmia preziosi test RT-PCR. Tutto evidenzia l'importanza del test sierologico per ottenere stime più accurate della pandemia. 



BIBLIOGRAFIA

  1. Okba NMA, Müller MA, Li W, Wang C, GeurtsvanKessel CH, Corman VM, et al., Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2−specific antibody responses in coronavirus disease 2019 patients. Emerg Infect Dis. 2020 Jul [date cited]. doi: https://doi.org/10.3201/eid2607.200841                                                               
  2. Mehta P, McAuley DF, Brown M, et al., COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet 2020 Mar 16 Epub ahead of print.
  3. Ritchie AI, Singanayagam, A. Immunosuppression for hyperinflammation in COVID-19, a double-edged sword? Lancet 2020:1.
  4. Huan Ma, Weihong Zeng, Hongliang He, et al., COVID-19 diagnosis and study of serum 1 SARS-CoV-2 specific IgA, IgM and IgG by a quantitative and sensitive immunoassay. MedRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.17.20064907
  5. Yuan, M., et al., A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science (2020).
  6. Fatima Amanat, Daniel Stadlbauer, Shirin Strohmeier, A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. MedRxiv preprint  doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.17.20037713
  7. Quan-Xin Long, Bai-Zhong Liu, Hai-Jun Deng, Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nature medicine.  doi: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0897-1

 



 

PANDEMIA COVID-19 E IL RUOLO CRITICO DEL LABORATORIO

 

La diagnostica in vitro è essenziale per la clinica, nell’infezione SARS-CoV-2, nelle seguenti aree: a) la diagnosi eziologica, b) il monitoraggio dei pazienti, c) la sorveglianza sierologica. Il ruolo delle S.C. di laboratorio è principalmente di tipo reattivo, ma con migliaia di infettati, le virologie sono state saturate, essendo previste per un volume di attività normale “customer oriented”.

  1. Il test per la diagnosi eziologica di SARS-CoV-2 è la Real Time PCR (protocollo OMS) (1) su campioni clinici respiratori o di siero, essenziale per la definizione di nuovo caso e per inviare i dati alla Sorveglianza Epidemiologica; è eseguito nei Laboratori di Riferimento Regionali, individuati dalle Direzioni Regionali Sanità; in caso di positività per SARS-CoV-2 il campione viene mandato per conferma all’ISS (2), secondo le direttive ministeriali (3).  L'OMS ha selezionato protocolli, a norma, per lo sviluppo di test RT-PCR, poi diffusi ai laboratori di riferimento mondiali; tutti i centri nazionali si sono adeguati (4). I campioni sono prelevati dalle basse vie respiratorie o dalle alte. Se un paziente fortemente sospetto, risulta negativo, si ripete il prelievo da siti diversi (naso, espettorato ecc.). Campioni di sangue, urine e feci possono essere inviati in laboratorio per approfondimenti. La manipolazione richiede precauzioni e DPI completi per il personale (5). 
  2. Specifici test di laboratorio sono indicatori di evoluzione verso ARDS, CID, insufficienza multiorgano. La letteratura ha evidenziato le più importanti anomalie nel COVID-19: linfopenia, aumento di CRP, LDH, VES e D-dimero, ridotta albumina sierica. I parametri ematologici indice di progressione sono: leucocitosi, neutrofilia, linfopenia e MDW (distribuzione del volume dei monociti) (6). Sono prognostici LDH, AST, ALT, bilirubina totale, creatinina, troponina, D-dimero, tempo di protrombina (PT), pro-calcitonina e CRP (6). Tra i test di emostasi PT, D-dimero e coagulopatia da consumo predicono l’evoluzione infausta (6). Nei casi di COVID-19 grave spicca l'iperinfiammazione: ferritina, conta piastrinica, VES e score HS per HLH (linfoistiocitosi emofagocitica) indicano il rischio di progressione verso la mortalità (7). L’infiammazione non regolata altera i parametri N8R e NLR, decisivi per attuare un intervento tempestivo, basato su dosaggio longitudinale di linfociti e citochine (8). 
  3. Il dosaggio di anticorpi anti-SARS-CoV-2, di classe IgM e IgG, ha valore di ricerca e di monitoraggio; i migliori kit si dimostrano accurati (89% sensibilità e 91% specificità) (9) e sono adatti per la sorveglianza sierologica.

Lessons learnt: le risorse sanitarie si sono rivelate insufficienti, ovunque nel mondo, per gestire il numero di pazienti; la scarsità di DPI ha causato il contagio dei tecnici. Nei laboratori, i sistemi analitici sono parzialmente chiusi, ma manipolazione dei campioni e aerosol non si possono evitare. Il reclutamento di nuovo personale ha aggiunto il carico dell’addestramento. La creazione di una rete tra i laboratori, con trasporto veloce dei campioni, è una soluzione possibile, purché la logistica sia organizzata in condizioni ottimali e in biosicurezza. Due aspetti finali: 1) il personale di laboratorio può venire infettato dal virus, come è avvenuto; 2) l’adeguamento alle limitazioni dei movimenti umani e del trasporto. Tali criticità amplificano la carenza di personale ed evidenziano la necessità di piani per l’emergenza epidemica (6). La cultura dell’HTA migliora le tecnologie, la sicurezza, e l’uso appropriato di risorse per fronteggiare la saturazione, suggerendo l’utilizzo dei POCT nelle unità di isolamento, con supervisione del laboratorio. Nei punti critici, anche sul territorio, essi hanno dei vantaggi: risposta rapida, prelievo capillare, nessuno spostamento di campioni infettivi, interfacciamento con la rete di laboratorio. Dal 2005, l’OMS invita i suoi stati membri a prevedere tali aspetti organizzativi in previsione di pandemie (10).

 

BIBLIOGRAFIA

1. Corman V, Landt O, et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance   2020; doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

2. Epicentro, Istituto Superiore di Sanita (ISS). Sistema di sorveglianza nazionale. https://www.epicentro.iss.it/coronavirus/sars-cov-2-sorveglianza-dati

3 .Annullamento e sostituzione della Circolare del Ministero della Salute n. 0009480 del 19 marzo 2020 “COVID-19: rintraccio dei contatti in ambito di sorveglianza sanitaria e aggiornamento delle indicazioni relative alla diagnosi di laboratorio di casi di infezione da SARS-CoV-2". Circolare del 20 marzo 2020  http://www.trovanorme.salute.gov.it/norme/renderNormsanPdf?anno=2020&codLeg=73714&parte=1%20&serie=null

4. World Health Organization. Laboratory testing strategy recommendations for COVID-19. Interim guidance, 22 marzo 2020; https://apps.who.int/iris/handle/10665/331509

5.Ministero della Salute. COVID-19. Aggiornamento della definizione di caso. Circolare del 09/03/2020; http://www.trovanorme.salute.gov.it/norme/renderNormsanPdf?anno=2020&codLeg=73622&parte=1%20&serie=null

6. Giuseppe Lippi and Mario Plebani, The critical role of laboratory medicine during coronavirus disease 2019 (COVID-19) and other viral outbreaks. Clin Chem Lab Med 2020; aop  https://doi.org/10.1515/cclm-2020-0240

7. Puja Mehta, Daniel F McAuley Michael Brown, Emilie Sanchez, Rachel S Tattersall, Jessica J Manson et al.,  On behalf of the HLH Across Speciality Collaboration.  UK Lancet, March 12, 2020; https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30630-9

8. Jing Liu , Sumeng Li , Jia Liu , Boyun Liang  et al., Longitudinal characteristics of lymphocyte responses and cytokine profiles in the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected patients. EBioMedicine (2020); https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102763

9. Gigi Gronvall PhD, Nancy Connell PhD, Prof. Amanda Kobokovich, Rachel West PhD, et al., Developing a National Strategy for Serology (Antibody Testing) in the United States. Published on April 22, 2020 Copyright © 2020 Johns Hopkins University

10. Di Lorenzo Pradelli, Albert Wertheimer, Ceri J Phillips, AnkePeggy Holtorf, Farmacoeconomia in pratica: Tecniche di base e modelli. SEEd Editore 2014  ISBN 8897419585, 9788897419587

 

Carla Lavarini